线粒体病是儿童期常见的遗传代谢病之一，发病率至少为1/5 000。由于线粒体分布广泛，多器官受累是本病临床特点，常常累及脑、骨骼肌、眼、耳、消化、内分泌、心血管、肾脏及血液系统等。线粒体是"能量加工厂"，为人体提供90%以上的ATP，能量需求大的组织如脑、骨骼肌、肝脏、心肌和视网膜等线粒体分布多，反之，则线粒体分布少，造成了线粒体组织分布的异质性。线粒体病的遗传方式复杂，涉及到线粒体基因(mtDNA)的母系遗传和核基因(nDNA)的孟德尔遗传，遗传异质性强，给基因诊断带来很大困难。一般的诊断流程包括临床表现、生化代谢和影像学检查等，当高度怀疑线粒体病时需进行基因检测。基因检测阴性时，应重新进行临床评估，仍然怀疑线粒体病时，需要进行肌肉或皮肤活检，进行病理学分析和呼吸链酶学检测，同时进行组织标本遗传学分析。
由于线粒体病涉及基因较多，利用一代基因检测方法进行逐个基因筛选，不仅耗时长、费用高，而且检出率不高。自2009年二代测序技术开始用于线粒体病的诊断以来，线粒体病的基因诊断有了突飞猛进的发展，帮助我们诊断和认识了一些罕见的线粒体病，提高了诊断水平，同时也带来了一些新的问题。如何将传统的基因诊断手段和二代测序技术结合起来，如何合理运用和分析二代测序结果，努力提高我国儿童线粒体病的诊治水平，需要广大临床医生认真思考。
一、正确认识儿童常见线粒体综合征的临床表现和遗传特征
1．线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作(mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke–like episodes，MELAS)：
这是儿童时期最常见的母系遗传线粒体脑肌病，以进行性脑病、癫痫发作、眼睑下垂、肌无力、易疲劳、乳酸酸中毒和卒中样发作为特征，伴有多毛、身材矮小等。头颅CT或MRI多表现为非血管分布的脑梗死样改变，以头部后面为主，后期出现皮质及小脑萎缩，基底节区也可受累，表现为对称性钙化。当临床怀疑本病时，可以直接进行mtDNA A3243G检测。80%的MELAS由编码tRNALeu基因的A3243G突变所引起，其次为tRNALeu的T3271C，占7%～15%。其他致病突变包括G583A、C3256T、T3291C、G3697A、G4332A、G12147A、G13513A和A13514G等。
2．肌阵挛癫痫伴破碎红肌纤维(myoclonic epilepsy associated with ragged red fibers，MERRF)：
这是另一种母系遗传线粒体脑肌病，较MELAS少见，临床以肌阵挛发作、癫痫、共济失调和乳酸增高为主要特征。临床怀疑本病时可直接进行mtDNA A8344G突变检测。MERRF最常见的mtDNA突变为编码tRNALys的A8344G，其他致病突变包括T8356C、G8363A、G12147A、7472insC等。
3．Leber遗传性视神经病(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)：
为母系遗传的线粒体病，呈急性或亚急性起病，病前身体健康，以双眼无痛性视力减退为主要表现，双侧同时发病占25%，双眼先后发病者占75%，间隔6～8周。男性青壮年好发，G11778A、T14484C、G3460A 3种突变占LHON的95%以上。临床怀疑LHON可直接检测上述3种突变位点。
4．Kearns–Sayre综合征(Kearns–Sayre syndrome，KSS)、Pearson综合征和慢性进行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia，CPEO)：
是3种较常见的线粒体缺失综合征，其发病机制相似，临床症状取决于mtDNA缺失片段的大小及区域和在不同组织中的分布。除Pearson综合征能在血液标本中检测到大片段缺失外，其他两种只能在肌肉组织中检出。
5．Leigh综合征(Leigh syndrome, LS)又称为亚急性坏死性脑脊髓病(subacute necrotizing encephalomyelopathy)：
是一种进行性神经退行性疾病，是婴幼儿期最常见的线粒体脑病。本病的典型表现为认知及运动功能急速退化和头颅MRI基底节或脑干对称性病灶。LS遗传特征复杂，最具遗传异质性，线粒体氧化磷酸化系统中任意一种呼吸链酶复合物缺陷或联合缺陷均可致病，其中以呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ缺陷最多见，另外，辅酶Q10缺陷和丙酮酸代谢障碍也可导致本病。由线粒体基因编码的呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ缺陷导致的LS称为母系遗传LS(MILS)，其中，T8993G/C突变导致的MILS占10%，其他，如G13513A、T14487C等突变占10%～20%。根据临床表现和头颅MRI改变，临床诊断LS不难，但由于致病基因众多，采用一代测序不仅耗时长、花费高，而且阳性率低，故二代基因检测技术更适合本病。
6．Alpers–Huttenlocher综合征：
是由POLG基因突变导致的以药物难治性癫痫、精神运动发育迟滞和肝脏受累为主的一种线粒体病，丙戊酸可诱发肝衰竭，多数患儿在发病后几个月内死亡，个别可生存数年。头颅MRI显示枕叶皮层急性缺氧改变。临床怀疑本病时可检测POLG基因。
二、合理选择标本和基因检测技术诊断线粒体病
合理选择标本和基因检测技术的前提是了解线粒体病的临床和遗传特点，只有了解这些特征才能合理选择，少走弯路，提高诊断正确率。线粒体病临床复杂，部分表现为典型或非典型综合征，部分则不能归为某一类线粒体综合征。相同的临床表型在不同的患者，其基因型不同，相同的基因型在不同的患者，有不同的临床表型，这些特征给线粒体病诊断增添了困难。对于一些典型的线粒体综合征，mtDNA热点突变筛查能使大部分患者得到确诊，如MELAS检测A3243G突变，MERRF检测A8344G突变，LHON检测G11778A、T14484C和G3460A 3种突变，MILS检测T8993G/C、G13513A和T14487C 3种突变。因此，mtDNA热点突变筛查仍为线粒体病分子诊断中的第一步骤，当血标本中未检测到突变时，应排除假阴性结果。研究发现血液中A3243G突变随年龄增加而递减，尿液标本阳性率高于血标本，故最好检测血液标本的同时送检尿液标本。除外假阴性结果后，需利用二代技术进行mtDNA全基因组(16 569 bp)测序，测序阴性则需进行肌肉病理检查并选取肌肉标本进行mtDNA全测序，在线粒体母系遗传分子学诊断过程中一定要考虑到组织分布特异性这一特征。对于临床表现不典型，不能归为某一类综合征者，也可以直接进行mtDNA全基因组测序。
由于LS遗传复杂，最好的办法是通过组织标本或皮肤成纤维细胞培养进行呼吸链酶活性测定，在酶学基础上再进行基因筛查。国外一项回顾性多中心研究表明，180例线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ缺陷，47例发现SURF1基因突变；而国内在145例LS中，仅2例发现SURF1基因突变。酶学检测可以提高基因确诊率，但组织酶活性测定需要严格的实验室条件和技术要求，且为有创性检查，国内尚未开展。
随着二代测序技术的发展，其通过基因捕获技术，捕获目标基因或全外显子，对大量候选基因或全外显子进行平行测序，有着测序通量高、简单、快捷、花费低等优点，可使部分线粒体病患者避免有创的检查，使线粒体病的诊断有了突破性的进展，尤其是LS和一些罕见的线粒体病。逐步认识和了解这些经基因确诊的线粒体病临床表型，可为以后的诊断提供很好的思路，总结规律，缩小筛查范围，甚至可以直接通过一代Sanger测序进行致病基因检测。例如我们曾经收治一例2岁3个月的松软儿，乳酸轻度增高，尿代谢筛查提示甲基丙二酸轻度增高，血串联质谱提示丙酰肉碱(C3)、甲基丙二酰肉碱(C4DC)轻度升高，头颅MRI示双侧尾状核头部、壳核对称性异常，临床不支持甲基丙二酸尿症，考虑为LS，直到3年后，通过靶向基因捕获测序发现SUCLA2基因突变，才明确诊断为线粒体DNA耗竭综合征。有了该例经验，第2例患者很快得到了确诊。
三、正确分析遗传检测结果及其临床意义
mtDNA全基因组测序不仅能筛选致病性点突变、片段缺失，同时也检出一些致病性不明的点突变，在基因诊断中存在陷阱，需要较丰富的遗传学知识结合临床做出判断。如D–loop是线粒体DNA环上唯一的非编码区，检测到D–loop区突变一般是不致病的。mtDNA全基因组包含37个基因，16 569个碱基对，为裸露的环状双螺旋结构，不含有内含子。氧化磷酸化过程中产生的大量氧自由基造成线粒体DNA较易突变，其突变率较nDNA高10～17倍，且不具备自我修复能力。目前，人类线粒体基因组数据库MITOMAP(http://www.mitomap.org)收录了60个已证实的致病点突变，如果检测到这些突变，临床表型也符合，可以确诊。因线粒体遗传多为母系遗传，建议进行母系成员致病突变检测，为避免血样中的假阴性，最好血、尿同时采样送检。如果检测到的是有过报道的突变，需要进行认真分析，不要盲目下诊断。首先了解临床是否相符，其次检索突变是否对蛋白结构和功能造成影响，是否进行了功能研究等。例如我们确诊为线粒体DNA耗竭综合征的患儿，检测到mtDNA G5821A100%突变，文献报道此突变为耳聋辅助突变，不仅与临床不符，而且致病意义不明，因此不能就此突变做出诊断。所以，对mtDNA全基因组测序发现的突变一定要进行严格筛查，是人类线粒体基因组数据库MITOMAP中证实为致病性突变的可确诊，未经证实的需谨慎做出诊断。
对于核基因靶向捕获测序结果是已报道的致病性突变，临床和遗传方式均吻合的话，可以诊断。对于未报道过的新突变，临床医生要结合遗传学意义和临床综合分析，可从以下几个方面对致病性进行推测：(1)非已知的单核苷酸多态性(SNPs)，查询SNPs数据库和在大规模正常对照中(千人基因组或本地正常人)未检测到此变异。(2)突变对蛋白结构和功能可能有明显影响，如移码、剪切、缺失和无义突变；或经过功能预测软件预测位于高度保守区、导致氨基酸变异较大的错义突变。(3)符合孟德尔遗传特征。
无论是传统测序还是二代测序诊断线粒体病，其确诊率仍在30%左右，线粒体结构和功能涉及1 500多个基因，发现的致病基因仅200余个，所以基因诊断率不高。对于基因检测阴性，临床仍然高度怀疑线粒体病的患者，需要进行组织标本的酶活性检测。呼吸链酶复合物Ⅰ分子量最大，结构最复杂，亚基最多，含有44个亚基，已经明确其中7个亚基由线粒体基因编码，以及由核基因编码的16个亚基基因突变与线粒体病有关，其余均不详，造成约半数亚基致病性不明。
总之，线粒体病是临床和遗传异质性较高的疾病，典型的线粒体综合征首先要选取敏感的组织进行热点突变筛查，不要盲目进行二代测序。随着遗传学检测技术的飞速发展，检测成本的进一步降低和检测时间的进一步缩短，给遗传异质性较强和罕见的线粒体病带来新的契机和发展。相信在不久的将来，将会有越来越多的致病基因被发现，越来越多的线粒体病得到诊断，不仅可为患者的治疗和预后评估提供重要依据，也可为患者及家属进行遗传咨询、产前诊断，同时也为线粒体病发病机制和靶向治疗的研究奠定基础。
（参考文献略）
