A Sensitive and Specific LC-MS/MS Method for Rapid Diagnosis of Niemann-Pick C1 Disease from Human Plasma

一种利用人体血浆快速诊断尼曼匹克病C1型的灵敏有效的液体色层串联质谱测定方法（LC-MS/MS）

Xuntian Jiang,1 Rohini Sidhu,1 Forbes D. Porter, 2 Nicole M. Yanjanin,2 Anneliese O. Speak,3 Danielle Taylor te Vruchte,3 Frances M. Platt,3 Hideji Fujiwara,1 David E. Scherrer,1 Jessie Zhang,1 Dennis J. Dietzen,4 Jean E. Schaffer,1 and Daniel S. Ory1,*

1 Diabetic Cardiovascular Disease Center, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63110;

2 Program in Developmental Endocrinology and Genetics, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, DHHS, Bethesda, MD 20892;

3 Department of Pharmacology, University of Oxford, UK; and

4 Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63110

First Published on April 24, 2011, doi: 10.1194/jlr.D015735.

July 2011 The Journal of Lipid Research, 52, 1435-1445.

翻译：刘海涛，校对：肖磊

【摘要】：

 NPC1(Niemann-Pick type C1，尼曼匹克病C1型)疾病是一种罕见的渐进性致命性神经变性疾病，但目前并没有得到美国食品及药物管理局（FDA）认可的治疗方法。发展新的治疗方法的主要障碍是缺乏灵敏的，非侵入性的诊断测试。最近，我们证实，在NPC1患者实验组的血浆中，两类胆固醇氧化物含量显著增加，分别是cholestane-3β,5α,6β-triol(3β,5α,6β-triol)和7-ketocholesterol(7-KC)，相信它们将在以后NPC1疾病的诊断和治疗评定中扮演某种角色。在这篇文章中，我们描述了在对人体血浆进行N-二甲基甘氨酸(N-dimethylglycine)衍化之后，用一种灵敏有效的液体色层串联质谱测定（LC-MS/MS）,来测量3β,5α,6β-triol和 7-KC的含量。我们指出，二甲基甘氨酸衍化成功的增强了人体血浆中 3β,5α,6β-triol和 7-KC的电离和分裂性能，这为这两类物质的质谱测定(mass spectrometric detection)带来便捷。二甲基甘氨酸（dimethylglycine）可高灵敏度和选择性分解，并使人体血浆中的3β,5α,6β-triol及7-KC浓度精确定量成为可能。LC-MS/MS能够高精度的区分开控制组和NPC1实验组, 第一次提供了NPC1疾病的非侵入性，快速、高灵敏度的诊断方法。

【部分正文】：

 NPC疾病则以内脏和中枢神经系统中胆固醇和其他脂质的逐渐聚集为主要特征，是一种主要患者为儿童的罕见疾病，大约95%的NPC疾病案例是由NPC1基因突变导致，其余的则是由于NPC2基因的突变。童年早期出现动作不协调，以及运动能力和思维能力的持续受损，这些都是NPC疾病的典型症状，而且患病的孩子通常在青春期就早早离世。这种渐进性致命性神经变性疾病目前还没有FDA认可的治疗方法。尽管如此，目前一些可控实验和一系列的案列研究报告显示miglustat行之有效，这是一种目前在许多国家被允许用于疾病治疗的鞘糖脂(glycosphingolipid)生物合成抑制剂，包括欧盟，俄罗斯，巴西，澳大利亚，加拿大以及台湾。

 发展NPC1新的治疗方法的主要障碍是找不到一种便宜的非侵入性的诊断测试方式。目前的诊断标准有一种侵入性的皮肤活检以及filipin染色 (filipin staining)，而这些只在世界上少数几个特定的临床实验室才能做。这种诊断方法通常和一种所谓“异型”NPC ("variant" NPC) 混淆，这种“异型”NPC同样有标准的filipin染色，因此我们需要寻找新的诊断方法。由于皮肤活检复杂且缓慢，同时没有灵敏的filipin染色方法，NPC1的儿童患者常被极其可惜的耽误四年以上的治疗时间，而成年人则是六年，而尽早的开始治疗对这种疾病却至关重要。

NPC1功能丧失导致非酯化胆固醇的内溶酶体积聚，这是NPC疾病的特点。在NPC1缺陷细胞中，胆固醇积聚与细胞氧化应激（cellular oxidative stress）相联系，细胞内氧化族类（ROS）产物的增加，氧化破坏以及氧化应激的基因表达 (gene expression profile indicative of oxidative stress)均证实了这一点。在NPC1的小鼠模型中，氧化应激伴随着ROS含量升高，以及许多组织的胆固醇非酶促氧化。这些胆固醇氧化产物，尤其是在所有患者实验对象血浆中无一例外显著增加。这些3β,5α,6β-triol和7-KC标记物，在其他神经退化疾病以及溶酶体积聚疾病中并未发现异常，而对于NPC1疾病模型，治疗一开始，含量就出现下降。这些发现指出，3β,5α,6β-triol及7-KC是NPC1疾病的独特的生化标记，将在NPC1的诊断和治疗评定中扮演重要角色。

 到今天为止，通过气相色谱-质谱联用(gas chromatography -mass spectrometry)（GC-MS），生物标本中氧类胆固醇的含量理论上可测。尽管这个技术，提供了在复杂混合物中灵敏测量氧类胆固醇的方法，但同时被以下问题限制，劳动密集的标本准备，提取程序以及需要相当多的血浆量。

这里我们描述了在对人体血浆进行N-二甲基甘氨酸衍化之后，用灵敏的特定的液体色层串联质谱测定（LC-MS/MS）来测量 3β,5α,6β-triol及7-KC的含量。在这篇研究中，我们描述了一种非扩散的，快速且高度灵敏的方法来诊断NPC1疾病，并用这种方法来高精度的区分开控制组和NPC1实验组。

原文链接：http://www.jlr.org/content/52/7/1435.abstract?cited-by=yes&legid=jlr;52/7/1435

感谢瓷娃娃罕见病翻译项目志愿者刘海涛的翻译！