近日，Healiva和C4U公司宣布他们就开发CRISPR-Cas3技术对大疱性表皮松解症（EB）的治疗解决方案达成战略联盟协议。
Healiva 和C4U公司
Healiva是一家总部位于瑞士卢加诺的生物技术公司，由Bioseutica 和Priyanka Dutta Passecker博士于 2020 年创立。公司有细胞疗法、自体疗法：EpiDex®和同种异体细胞疗法等。
▲Healiva
C4U公司于2018年3月成立，专注于基于其专有的下一代CRISPR-Cas3基因编辑平台，为包括儿科在内的罕见疾病开发安全高效的基因疗法。CRISPR-Cas3技术平台在工程设计、效率和递送方法方面与CRISPR-Cas9相似，并且已经过体外研究和体内研究验证表明它具有以下明显优势：a.无脱靶缺失（提高安全性）; b.高效敲除大型可编程基因序列; c.完全独立的专利组合，由大阪大学在全球范围内独家授权给C4U用于真核细胞，从而简化了再许可交易，与复杂且诉讼激烈的CRISPR-Cas9专利环境形成鲜明对比。
▲C4U
CRISPR-Cas3基因编辑技术
CRISPR-Cas3技术是C4U的核心技术。CRISPR-Cas3是由C4U科学顾问委员会的创始人、东京大学医学科学研究所教授Tomoji Mashimo博士和大阪大学微生物疾病研究所客座教授Junji Takeda博士开发。
被广泛用于真核细胞中的基因组编辑，如II型Cas9或V型Cas12a（Cpf1）属于单组分2类CRISPR系统。2019年12月在nature communications杂志上，Tomoji Mashimo博士和Tomoji Mashimo博士团队研究者证明了I-E型CRISPR介导人类细胞中不同的DNA切割活性，并注意到具有解旋酶和核酸酶活性的Cas3主要触发了5′-ARG原间隔区相邻基序（PAM）上游的数千个碱基对缺失，而没有显著的脱靶活性。这种Cas3介导的定向和广泛的DNA降解可用于引入功能性基因敲除和敲入。研究拓宽了对1类CRISPR系统的理解。
▲图片来源：nature communications（参考资料2）
▲I-E型CRISPR效应器（图片来源：参考资料2）
▲Cas9双链断裂（图片来源：网络）
▲Cas12a产生粘性末端（图片来源：网络）
而早在2019年4月，密歇根大学的张燕和康奈尔大学的可爱龙等研究人员在Molecular Cell 杂志上发表研究，该研究发现CRISPR/Cas3可以在人胚胎干细胞中实现有效筛选非编码遗传元件并实现大片段的基因敲除，编辑效率高达13％-60％。这是Ⅰ型CRISPR/Cas系统首次在真核系统实现基因编辑，这一发现表明Ⅰ型CRISPR/Cas系统在真核系统中有巨大的基因编辑潜力和应用价值。
Cas9系统使用sgRNA来识别目标DNA序列，识别匹配后，sgRNA将Cas9蛋白精确引导到目的DNA序列，然后Cas9蛋白就会在正确的位置切割目标DNA。虽然CRISPR/Cas3使用相同的机制来定位目标DNA序列，然而，Cas3不是仅仅将DNA双链一切为二，而且会连续消除DNA片段，最多可长达100K碱基对。研究人员正在努力控制Cas3对DNA敲除的长度。目前还无法准确定义其敲除边界，这对于治疗来说是一个必须要解决的缺点。
▲图片来源：Molecular Cell（参考资料3）
▲T.fusca I-E型CRISPR-cas基因座(图片来源：参考资料3)
2023年8月，日本京都大学的 Akitsu Hotta 团队在Stem Cell Reports 上发表了研究，该研究开发了一种双重CRISPR-Cas3系统进行多外显子跳跃（MES），能够诱导杜氏肌营养不良（DMD）患者来源的诱导多能干细胞的肌营养不良蛋白（Dystrophin）基因外显子45-55区域的大片段缺失（~340kb），产生截短但仍有功能的肌营养不良蛋白，该方法能够覆盖60%以上的DMD患者。此外，该研究未发现明显的脱靶缺失。研究表明，相较于已上市的几款治疗DMD的反义寡核苷酸（ASO）药物（能覆盖少数特定突变位点的DMD患者，通过外显子跳跃达到治疗目的），双CRISPR-Cas3系统可通过多外显子跳跃（MES）诱导大片段基因组缺失，启发了治疗DMD和其他需要大量删除基因片段的遗传疾病的新方法。同时此次原始的CRISPR-Cas3表达载体由C4U科学顾问Tomoji Mashimo博士提供。
▲图片来源：Stem Cell Reports（参考资料4）
▲图片来源：参考资料4
此外研究团队指出了这种双CRISPR RNA系统的潜在局限性。a.删除模式存在变异，其精确起点和终点无法完全控制。当需要大量但精确删除时，这可能是一个缺点。b.该研究没有证明肌营养不良蛋白功能的恢复情况。c.还需要开发其他方法来提高Cas3系统的整体基因组编辑效率。这也是未来CRISPR-Cas3需要继续研究发展的内容。
CRISPR-Cas3的应用
Noil-Immune
2020年5月，C4U宣布与Noile-Immune生物技术公司合作，利用CRISPR-Cas3基因组编辑技术开发Noile-Immune公司的PRIME高活性异体CAR-T疗法，PRIME技术是Noile-Immune的核心技术，与基因修饰免疫细胞疗法有关（抗癌CAR-T细胞和TCR-T细胞）。
Hokkaido University
2021年7月，C4U宣布已开始与北海道大学药学部药剂学分子设计实验室联合研究使用脂质纳米颗粒的CRISPR-Cas3递送系统。
National Center for Child
Health and Development
2021年8月C4U宣布和日本国家儿童健康与发展中心已开始利用CRISPR-Cas3技术联合研究遗传疾病的细胞疗法。
Sumitomo Pharma
2022年1月，C4U宣布和住友大日本制药已进入下一阶段的联合研究，旨在通过指定中枢神经系统疾病领域的靶基因和细胞来应用CRISPR-Cas3。这一进展是基于2021年8月3日宣布的联合研究取得的。
Logomix
2022年6月，C4U宣布和Logomix已就将CRISPR-Cas3基因组编辑技术应用于 Logomix 的 Geno-Writing技术达成联合研究协议。
Brain Research Institute
2022年10月，C4U宣布与新泻大学脑研究所签订了利用CRISPR-Cas3技术的新型基因疗法的合作研究协议。
Rege Nephro
2023年7月，C4U宣布和Rege Nephro签订了一项非排他性协议，授予Rege Nephor制造和销售从PKD1基因敲除诱导多能干细胞（iPS细胞）分化而来的细胞的权利。Rege Nephro使用 CRISPR-Cas3技术生产这种PKD1基因敲除iPS细胞，其产品将用于发现新的治疗药物，以治愈常染色体显性（显性）多发性囊性肾病（ADPKD）。
结语
目前全世界研究最多的基因编辑技术是CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas3因不受Cas9复杂的专利状况影响，作为一种前景广阔的基因组编辑技术而备受关注。2023年5月，C4U公开其B轮融资筹集了总计15亿日元（按当时有效汇率计算约为1100万美元）。自2021年A轮融资（筹集了850万美元（9.3 亿日元））以来一直担任领投方的DCI Partners和其他6名投资者（包括 4名新投资者）参与了本轮 B 轮融资。自2018年3月成立以来，累计资金已达26亿日元，C4U计划将资金用于进一步研发CRISPR-Cas3系统及其在医疗领域的应用，特别是体内和体外治疗。
2.Hiroyuki Morisaka, Kazuto Yoshimi, Yuya Okuzaki, et al. CRISPR-Cas3 induces broad and unidirectional genome editing in human cells.Nature Communications. 5302 (2019).（https://www.nature.com/articles/s41467-019-13226-x）
4.Yuto Kita, Yuya Okuzaki, Youichi Naoe, et al.Dual CRISPR-Cas3 system for inducing multi-exon skipping in DMD patient-derived iPSCs.Stem Cell Reports.2023.（https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711(23)00295-3）
