视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSDs)是一组由抗水通道蛋白4-免疫球蛋白G（AQP4-IgG)介导的神经系统自身免疫病，利妥昔单抗治疗有效，但具体机制尚不明确。研究人员对63例NMOSDs患者的配对颈深淋巴结（dCLNs）和血液样本进行了分析，发现临床复发与AQP4-IgM的产生或AQP4-IgG亚类转移，即生发中心的活性有关，使用利妥昔单抗后，患者临床复发率、结内合成的AQP4-IgG及AQP4反应性B细胞水平均显著降低。这表明，生发中心活性是NMOSDs患者抗AQP4抗体生成的驱动因子，也是利妥昔单抗作用的主要靶点。
AQP4-IgGs以IgG1亚类为主，通过特异性攻击富含AQP4的星形角质细胞而致NMOSDs发生。此病常易复发，逐渐累积致残。但临床发作的免疫生物学基础仍不清楚，同时缺乏可准确预测复发的生物学标志物。自身抗体有两种产生途径：1. 生发中心（GCs）中的抗原反应性B细胞在滤泡辅助性T细胞（Tfh）的帮助下，经过基因重排、体细胞高频突变等过程生成多样化的免疫球蛋白，持续的GCs活性可能是自身抗体（如AQP4-IgGs）长期存在的原因；2. 骨髓微环境中的长寿浆细胞（LLPCs）经历免疫事件后可存活数十年，分泌90%以上的血清IgG，其中包括各种自身抗体。迄今为止，一系列研究表明GC活性可能在AQP4-IgG的产生中发挥重要作用。
一、AQP4-IgG亚类、AQP4-IgM的动态改变与复发有关
接受利妥昔单抗治疗的NMOSDs患者（35/63）年复发率均显著降低（图1A、1B），用药后几个月内效果最明显，其中89%的患者（31/35）成功停用其他免疫疗法。同时纵向采集406份NMOSDs患者的血清学样本进行AQP4抗体检测。结果显示，在整个病程中，45%（10/22）接受利妥昔单抗治疗的患者、61%（17/28）接受其他免疫治疗者的AQP4-IgG亚类均以IgG1为主，IgG3、IgG2、IgG4出现的频率逐次降低。AQP4-IgG主要亚类在39%（24/61）的临床复发前后发生了转变，而远隔复发期（>8周）采样标本的转变率仅为16%（40/255）。AQP4-IgG主要亚类的转变可能是基因重组激活，即GCs活性的体现，如果这一过程是由原始B细胞重新进入GCs所驱动的，那么也应伴随着AQP4-IgM的产生。事实上，44%（22/50）的患者多次AQP4-IgM检测为阳性，并与48%（29/61）的复发密切相关，而远隔复发期样本中AQP4-IgM的阳性检出率仅为12%(37/316)（图1D、1E）。总体来看，AQP4-IgM的产生或AQP4-IgG亚类转移与NMOSD复发有关，GCs是复发期AQP4抗体合成的源头之一。
图1 NMOSD患者血清学表现与病情复发和利妥昔单抗的关系
二、利妥昔单抗可抑制dCLNs中AQP4-IgG的局部合成
对NMOSDs患者（n=14）和对照者（n=14）的dCLNs样本进行抗体分析(图2A)，结果显示，在无明显标本感染的情况下，同一个体中dCLNs总IgG、IgM水平较血清分别低1500倍、500倍(图2B、图2C)。与血液标本相比，dCLNs中单核细胞、过渡型B细胞水平较低，而Tfh细胞比例更高。所有对照者dCLNs或血清样本中均未检出AQP4-IgGs，而未接受利妥昔单抗治疗的7例NMOSD患者dCLNs标本AQP4-IgG检测均呈阳性(图2D、2E)，血清终点稀释度为1:100～1:3200，同一患者dCLNs的AQP4-IgG/总IgG值较血清高200倍(图2E、2F、2G)，以上提示AQP4-IgG的局部(“结内”)合成。此外，有2例患者dCLNs样本AQP4-IgM检测阳性而血清学为阴性，也有力证明了这一观点(图2E)。相比之下，在利妥昔单抗给药后不同时间点采集的dCLNs样本中，只有18%（2/11）的患者检测到AQP4-IgG或AQP4-IgM (图2 G)。以上结果表明，利妥昔单抗可有效抑制AQP4-IgG的结内合成，甚至在用药前NMOSD患者dCLNs内就已存在AQP4特异性B细胞。
图2 颈淋巴结标本中存在AQP4抗体，利妥昔单抗给药后被清除
三、AQP4特异性B细胞在dCLNs和血液中的表达
从3名NMOSDs患者的dCLNs和血液标本中提取单个B细胞进行诱导分化，并检测上清液中AQP4-IgM、AQP4-IgG的活性(图3A)。11/8293的B细胞分泌AQP4-IgM/IgG，考虑到体外培养细胞的存活率为50%，这相当于dCLNs和血液标本中B细胞的0.2%(图3B、图3C)。共有原始B细胞(n=4)、双阴性(n=1)、IgD+(n=2)及IgD-(n=4)记忆细胞4种类型(图3A、图3D)，所有细胞均表现为不同程度的VDJ基因重排，并伴有k:λ链2:1表达，其中来自原始细胞的同源重链和轻链未发生突变，但突变负荷增加。dCLNs中检测到的AQP4抗体都来自转换记忆(IgD-)细胞，2例上清液可检测到AQP4-IgG活性，其余均为AQP4-IgM。可见，从外周血单核细胞、dCLNs中分离出来的AQP4特异性B细胞起源于不同发育阶段B细胞亚群的遗传多样性。
图3 NMOSDs患者dCLNs、血液中AQP4特异性B细胞的表达情况
四、利妥昔单抗可有效耗竭dCLNs中的B细胞
应用利妥昔单抗后患者血液、dCLNs中的B细胞水平分别下降了198倍、430倍，B细胞亚类、抗体分泌细胞、Tfh细胞无明显改变，CD20+ T细胞轻度减少(图4A)。利妥昔单抗对结内B细胞的消耗作用可持续数月，与未应用或单次用药的NMOSD患者相比，多次给药者效果最显著(图4B)。为了在个体内进行纵向验证，对4名患者进行给药前后的取样分析，结果显示，在应用利妥昔单抗后的3～12个月内，所有患者的血清AQP4-IgG水平不变，而dCLNs中的AQP4-IgG终点稀释度从1:100、1:250直至测不出，且结内AQP特异性B细胞消失或始终测不出(图4C)。可见，利妥昔单抗可显著减少dCLNs中B细胞和AQP4-IgGs水平，而对血清AQP4-IgGs没有影响。
图4 注射利妥昔单抗后结内B细胞迅速耗竭
由此可见，纵向GCs活性是AQP4-IgG合成的潜在驱动因素，可作为预测NMOSDs患者复发的有效指标。利妥昔单抗给药前后的dCLNs采样分析表明，抗CD20治疗可显著消除NMOSDs患者结内B细胞和相应的AQP4特异性GCs活动，而血清中AQP4-IgG水平不受影响，即通过直接消除GCs的活性发挥作用。这也就解释了利妥昔单抗治疗NMOSDs起效快速，但患者血清抗AQP4抗体水平无改善的“临床-血清学”矛盾现象，后者可能与骨髓微环境中LLPCs的抗体合成有关。
在NMOSDs患者中，经典的抗原特异性GCs活性需考虑多种因素：血清AQP4-IgG水平比脑脊液要高出1000倍，这支持AQP4介导自身免疫的外周启动，早期外周B细胞即丧失耐受性；临床复发期间，患者血清AQP4-IgM显著升高，这提示GCs活性是由原始B细胞的优先招募而非IgG+记忆B细胞的重新激活驱动的。虽然其他区域淋巴结仍有待探索，但我们认为，dCLNs直接引流中枢神经系统（CNS）的淋巴液，极可能是CNS抗原驱动GCs活性发生的位点所在。
本研究揭示了NMOSDs的免疫学驱动因素及利妥昔单抗治疗的起效机制，同时为分析自身免疫病中GCs的作用提供了范例。GCs活性的生物标志物可能具有广泛的临床适用性，未来有望作为病情监测、疗效及预后评估指标在人类自身免疫病的精准管理中扮演重要角色。
